高通量測序技術(shù)（也稱為第二代測序技術(shù)）對于單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphism，SNP）或基因組的某個位置上的小片段序列（長度通常小于50bp）的插入或缺失（insertion-deletion，InDel）檢測較準(zhǔn)確，但是對于較大的結(jié)構(gòu)變異檢測卻非常困難。第三代測序技術(shù)以不需要PCR擴(kuò)增和長讀長為標(biāo)志，實現(xiàn)了對每一條DNA分子的單獨測序，因此也被稱為單分子測序技術(shù)。目前，已有長讀長測序的第三代測序平臺實現(xiàn)商業(yè)化，并廣泛應(yīng)用于科研領(lǐng)域，且有望在不久的將來用于臨床，進(jìn)一步提高基因組結(jié)構(gòu)變異等相關(guān)疾病檢出率。

 

 

　　2008年，Helicos BioSciences公司推出了全球第一款單分子測序平臺HeliScope，但該產(chǎn)品的序列讀長較短，系統(tǒng)整體測序錯誤率較高。隨后，針對單分子的長讀長測序技術(shù)出現(xiàn)。目前，長讀長測序平臺是指單分子測序長度不低于KB級別的技術(shù)平臺。如今，已經(jīng)實現(xiàn)商業(yè)化的長讀長測序平臺主要有Pacific Biosciences公司的單分子實時測序（single molecule realtime sequencing，SMRT）平臺和Oxford Nanopore Technologies公司的納米孔測序（Nanopore）平臺。

 

 

　　Pacific Biosciences公司開發(fā)的第三代測序技術(shù)稱為SMRT，該技術(shù)建立在兩項重要發(fā)明的基礎(chǔ)之上，有效攻克了測序領(lǐng)域測序讀長短的重大難題。其中，零模波導(dǎo)孔（zero-mode waveguides，ZMWs）技術(shù)可使激發(fā)光被限定在單分子納米孔底部的一定范圍之內(nèi)，有效過濾背景噪音；熒光基團(tuán)通過結(jié)合在核苷酸的磷酸基團(tuán)上，能夠幫助DNA聚合酶完成一個全天然的DNA鏈合成過程。

 

　　基于該原理的具體產(chǎn)品有PacBio Sequel測序儀、PacBio Sequel Ⅱ測序儀。PacBio Sequel測序儀是率先實現(xiàn)商業(yè)化應(yīng)用的第三代測序技術(shù)產(chǎn)品，其突破了傳統(tǒng)短讀長測序的諸多技術(shù)瓶頸。PacBio Sequel Ⅱ測序儀是PacBio Sequel的升級款，可提供CLR Library和CCSlibrary（HIFI）兩種測序模式，其測序芯片上的導(dǎo)孔（ZMW）由100萬個增至800萬個，理論通量較PacBio Sequel測序儀提升了8倍。同時，CCS reads（測序片段）的單堿基準(zhǔn)確度也有了較大提升，同一片段在測序4次后，準(zhǔn)確度可達(dá)約99%。

 

 

　　Nanopore是基于電信號測序的技術(shù)，原理是通過電場力驅(qū)動單鏈核酸分子穿過納米尺寸的蛋白孔道，不同的堿基在通過納米孔道時會產(chǎn)生不同阻斷程度和阻斷時間的電流信號，因此可根據(jù)電流信號識別每條核酸分子上的堿基信息，從而實現(xiàn)對單鏈核酸分子的測序。由于該測序技術(shù)的原理與其他平臺有較大差異，亦被稱為第3.5代或第四代測序技術(shù)。

 

　　Nanopore測序儀的具體產(chǎn)品種類較多，均為基于Nanopore芯片而搭建的平臺，大到由多個芯片陣列組成的PromehION、GridION系列測序儀，小到可以連接手機(jī)Type C接口、電腦USB接口的MnION系列便攜式測序儀。其中，PromethION是一款高通量、高樣本數(shù)的臺式系統(tǒng)，其具有48個測序芯片，每個芯片有多達(dá)3000個納米孔通道，總計達(dá) 14.4萬個納米孔通道。基于這種模塊化設(shè)計，測序芯片既可單獨運行也可同時運行，尤其適用于大樣本量、具有龐大數(shù)據(jù)量的項目。

 

　　上述兩類第三代測序平臺均具有長讀長、無GC偏好性以及可直接檢測甲基化修飾等優(yōu)點。相較而言，SMRT平臺無錯誤偏好，可通過增加數(shù)據(jù)糾錯以提高測序準(zhǔn)確度；Nanopore平臺讀長更長，可達(dá)到Mb級別，其中MnION測序儀的尺寸如手機(jī)大小，較為便攜（詳見表）。

 

 

　　目前，長讀長測序的第三代測序平臺已廣泛應(yīng)用于復(fù)雜動植物基因組、微生物基因組、全長轉(zhuǎn)錄組、微生物群體研究及人類基因組變異檢測等領(lǐng)域的科研項目中，以解決上述領(lǐng)域中檢測技術(shù)的瓶頸問題。

 

　　在疾病檢測方面，第三代測序技術(shù)基于其單分子檢測與長讀長測序的特點，在基因組結(jié)構(gòu)變異檢測、短串聯(lián)重復(fù)序列（微衛(wèi)星DNA）分析、單體型分析、真假基因區(qū)分、甲基化檢測等方面具有獨特的優(yōu)勢。盡管目前許多基于第二代測序技術(shù)的基因診斷產(chǎn)品已基本成熟，但因高通量測序技術(shù)存在讀長短、對基因組覆蓋不均勻等局限，對SNP和InDel s檢測尚可，但對復(fù)雜結(jié)構(gòu)變異的檢測卻無能為力。而第三代測序技術(shù)憑借長讀長、不需要PCR擴(kuò)增、無GC偏好性等優(yōu)勢，在用于腫瘤、遺傳病等基因檢測時，能夠進(jìn)行長片段序列（長度通常大于50bp）測定，可以檢測缺失、重復(fù)、倒位、易位等結(jié)構(gòu)變異，進(jìn)一步提高了疾病的檢出率，有效彌補(bǔ)了第二代測序技術(shù)對結(jié)構(gòu)變異檢測的不足。

 

　　相較于第二代測序平臺，第三代測序平臺大幅提升了序列讀長，但由于其錯誤率、成本及對樣本要求都較高，算法、軟件、數(shù)據(jù)庫等配套技術(shù)仍需進(jìn)一步研究，目前該平臺仍處于科研項目應(yīng)用階段。針對上述問題，各平臺正不斷優(yōu)化升級相關(guān)技術(shù)，如PacBio測序儀的HIFI技術(shù)模式可有效提高數(shù)據(jù)準(zhǔn)確度，Nanopore平臺也通過對Promet hION進(jìn)行設(shè)備升級以進(jìn)一步提高檢測準(zhǔn)確度。相信隨著第三代測序平臺的不斷發(fā)展，其未來在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域?qū)崿F(xiàn)轉(zhuǎn)化應(yīng)用后，將有效彌補(bǔ)目前針對基因組結(jié)構(gòu)變異等相關(guān)疾病檢測手段的空白。（作者單位：國家藥品監(jiān)督管理局醫(yī)療器械技術(shù)審評中心）