分析方法在藥學(xué)質(zhì)量研究中扮演重要的角色，普析手段目前還是在分析領(lǐng)域占據(jù)重要的位置，一般尤以RP-HPLC-UV占比最大，一個(gè)好的分析方法能有效檢出樣品中存在的所有雜質(zhì)，不遺漏某些雜質(zhì)的檢出，以免誤導(dǎo)工藝人員正確的開(kāi)發(fā)。 

分析方法的建立往往在原料藥的質(zhì)量研究中應(yīng)用頗多，選擇合適的分析方法建立思路，快速過(guò)渡，以QBD思想快速篩選，以獲得最優(yōu)的分析方法，對(duì)于質(zhì)量研究尤為重要。以下是我在實(shí)際工作應(yīng)用中對(duì)于方法建立等方面的一些心得。

 

分析方法建立的常規(guī)思路

 

仿制藥分析方法建立，一般有大量參考文獻(xiàn)，可以在文獻(xiàn)基礎(chǔ)上進(jìn)行優(yōu)化，事半功倍！ 

創(chuàng)新藥分析方法建立，一般參考文獻(xiàn)較少，在理論與經(jīng)驗(yàn)結(jié)合的基礎(chǔ)上快速建立方法！在RP-HPLC-UV建立之初，我們通常需要完成以下準(zhǔn)備：

 

 

流動(dòng)相pH值一般選取pKa±2范圍之外，以保障化合物處于分子狀態(tài)，減少電離，此狀態(tài)下化合物疏水性較強(qiáng)，色譜柱保留時(shí)間較長(zhǎng)，能獲得良好的峰型。

• 酸性化合物，可以選擇非緩沖的流動(dòng)相進(jìn)行pH調(diào)節(jié)，用單一的酸溶液（一般常用磷酸）進(jìn)行色譜分離，酸的濃度應(yīng)足以使pH值比需要值低的多。
• 堿性化合物，選擇是比較有限的，TEA/氨水可以用于調(diào)節(jié)到高的pH值，但是要求色譜柱能夠耐堿比較好。

緩沖體系選擇的要求：能適當(dāng)控制離子化、與檢測(cè)器兼容性、緩沖鹽溶液與有機(jī)相的互溶性、流動(dòng)相的pH是否在色譜柱的安全范圍內(nèi)。

常用的緩沖體系的鹽一般為磷酸鹽與醋酸鹽體系，其pKa見(jiàn)下表：

3、洗脫劑的選取
反相體系下，常用的洗脫劑為甲醇、乙腈與四氫呋喃。三種溶劑對(duì)比如下：

3、洗脫劑的選取

選擇性：α；柱效：N；保留因子：N

選擇性是影響分離度的最關(guān)鍵因素 ：

• 改變固定相 

• 改變流動(dòng)相

柱效是最容易預(yù)測(cè)和改變的因素；

最理想的保留范圍：1＜K＜10

  b. 影響分離度的色譜條件

    a. API與雜質(zhì)溶解性

直接影響：雜質(zhì)提取不充分，檢測(cè)結(jié)果不平行，重現(xiàn)性結(jié)果差！

間接影響：回收率波動(dòng)較大，方法建立與方法驗(yàn)證結(jié)果不匹配。

主成分在稀釋劑中的飽和溶解度，最好滿足飽和溶解度大于3倍的供試品濃度。

  b. 靈敏度

檢測(cè)靈敏度不滿足，高濃度溶解性會(huì)有問(wèn)題，濃度太大，峰拖尾影響檢測(cè)，易損壞色譜柱，在遺傳毒性雜質(zhì)方法建立過(guò)程中尤為突出。

  c. 酮式烯醇式互變

同一化合物有兩個(gè)響應(yīng)接近的峰，主峰伴隨著一個(gè)較大的未知峰，峰有臺(tái)階，互變影響峰型。 

具體可參考占小兵老師的“HPLC方法開(kāi)發(fā)需注意的典型特殊結(jié)構(gòu)化合物專題：酮式烯醇式互變”。

  d. 溶劑效應(yīng)

優(yōu)先采用流動(dòng)相體系，降低溶劑強(qiáng)度（如增加水相比例，調(diào)整pH等）。 

  e. 極性化合物弱保留

強(qiáng)保留型色譜柱（AQ色譜柱…..），離子交換色譜柱，離子對(duì)試劑， HILIC模式。 

離子對(duì)試劑 

• 酸性化合物：四丁基氫氧化銨、四丁基氯化銨、四丁基溴化銨、四丁基硫酸氫銨等。
• 堿性化合物：烷基磺酸鹽類，如戊烷磺酸鈉、辛烷磺酸鈉、庚烷磺酸鈉等。三氟乙酸、五氟丙酸等全氟取代的直連有機(jī)酸等。

防止漏檢雜質(zhì)，最重要的就是需要進(jìn)行分析方法可靠性評(píng)估，以判斷分析方法的適用性。 

分析方法的建立，是一個(gè)系統(tǒng)的工程，在有參考文獻(xiàn)的條件下，需要評(píng)估方法的可靠性；線性洗脫程序的合理性，也是檢驗(yàn)方法適用性重要的一環(huán)。

常規(guī)做法：

• 根據(jù)合成工藝路線及降解途徑分析可能產(chǎn)生雜質(zhì)的全面性。

• 采用強(qiáng)制降解試驗(yàn)來(lái)判斷方法的適用性。

• 延長(zhǎng)梯度洗脫高比例洗脫劑洗脫時(shí)間，防止小極性雜質(zhì)漏檢。

藥典方法不一定是最好的！