腹瀉病占全球兒童總死亡率的9%，每年約有44.6萬5歲以下兒童死亡。在撒哈拉以南的非洲和印度次大陸多個地點進行的旨在評估腹瀉病負荷及其病因的全面流行病學研究表明，隱孢子蟲原蟲是幼兒腹瀉病和死亡的主要原因；而人類隱孢子蟲和小隱孢子蟲是人類隱孢子蟲感染的主要原因。急性隱孢子蟲感染估計每年導(dǎo)致幼兒48,000人死亡，并損失420萬傷殘調(diào)整生命年(DALYs)。隱孢子蟲感染還與兒童生長遲緩有關(guān)。然而，這種疾病并不局限于低收入國家；盡管有先進的水處理技術(shù)，隱孢子蟲病在美國和歐洲也很常見。美國半數(shù)以上的水傳播疾病都是由隱孢子蟲引起的，通常與娛樂用水有關(guān)，環(huán)境中的部分隱孢子蟲孢子樣卵囊已經(jīng)對氯化反應(yīng)具有抗藥性。隱孢子蟲長期以來也被認為是一種機會性病原體，可導(dǎo)致免疫功能低下的人(如艾滋病毒/艾滋病患者或器官移植受者)受到威脅生命的感染。

    目前治療隱孢子蟲病的選擇很少，而且沒有可用的疫苗。FDA僅批準了一種治療隱孢子蟲病的藥物硝唑胺。硝唑胺可適度加速免疫能力個體的康復(fù)。然而，對于那些最需要它的病人：營養(yǎng)不良的兒童和免疫功能低下的人，它無法起到治療效果。最近對隱孢子蟲病的全部公共衛(wèi)生負擔的認識，提升了對隱孢子蟲病的關(guān)注，促進了抗隱孢子蟲治療方法的研發(fā)。用現(xiàn)有藥物來治療被忽視的熱帶疾病隱孢子蟲病，可能會降低經(jīng)濟成本。這種方法可以改變現(xiàn)有藥物的用途，或者利用現(xiàn)有藥物開發(fā)項目的化合物和結(jié)果來加速被忽視疾病的研究和降低成本。

    為了確定新的抗隱孢子蟲藥物先導(dǎo)和潛在靶點，美國伊利諾斯大學研究人員測試了具有已知作用機制的抗微生物化合物。一共集合了59個具有之前報道的抗菌活性的化合物，使用細胞為基礎(chǔ)的高內(nèi)涵顯微鏡分析測試作為篩選策略，來評估它們對愛荷華小隱孢子蟲株的作用。篩選發(fā)現(xiàn)了多種潛在靶點的抑制劑，包括細胞色素bc1復(fù)合物、熱休克蛋白90 (HSP90)、組蛋白去乙?；?HDACs)、磷脂酰肌醇4-激酶(PI4K)和多種tRNA合成酶。其中，鑒定的最有效的生長抑制劑是雙環(huán)氮雜環(huán)化合物 BRD3914，它對愛荷華Bunch Grass Farm小隱孢子蟲株的有效中值濃度(EC50)為62 nM。其原本就是正在開發(fā)用于治療瘧疾的雙環(huán)氮雜環(huán)系列，因此可以利用這些抗瘧研究中獲得的藥物化學經(jīng)驗來開發(fā)抗隱孢子蟲藥物。

    雙環(huán)氮雜環(huán)系列化合物通過抑制PfcPheRS發(fā)揮其抗瘧活性，研究人推測BRD3914的抗隱孢子蟲活性可能是抑制小隱孢子蟲 (C. parvum)的苯丙氨酰- tRNA合成酶 (CpPheRS)的直接結(jié)果。研究人員篩選出9種抗惡性瘧原蟲活性范圍從納摩爾到微摩爾的雙環(huán)氮雜環(huán)類化合物，并對其抗瘧原蟲活性進行了評估。結(jié)果表明，其對惡性瘧原蟲與小隱孢子蟲的抑制活性活性呈正相關(guān)(r = 0.883)，表明一種保守的作用機制對這兩種寄生蟲都起作用。繼而，研究人員對雙環(huán)氮雜環(huán)化合物衍生物的抗隱孢子蟲活性進行了評估，并在該系列中發(fā)現(xiàn)了不同的藥代動力學性質(zhì)的分子(dibasic, BRD7929; zwitterion, BRD3316和monobasic, BRD8494)。這些雙環(huán)氮雜環(huán)化合物顯示出廣泛的活性，與被測的C. parvum分離株無關(guān)，并且對C. hominis和C. parvum具有相當?shù)墓πАＬ貏e是在1%胎牛血清(FBS)] 的培養(yǎng)條件下，BRD7929對 C. parvum 的EC50 = 9 nM和C. hominis EC50 = 10 nM。

考慮到隱孢子蟲病治療的主要目標人群是2歲以下的兒童，必須滿足良好的安全性要求。研究人員評估了這6種化學同系物的細胞毒性，比較C. parvum愛荷華株(1%胎牛血清)的EC50與人回盲腺癌(HCT-8)細胞的半最大細胞毒性濃度(CC50)，觀察到所有化合物的選擇性指數(shù)為>100；特別是，BRD5630的選擇性指數(shù)可以達到> 10000。

    體內(nèi)實驗采用了隱孢子蟲病感染模型，利用3 ~ 4周大、剛斷奶、嚴重合并免疫缺陷型(NSG)小鼠，口服小隱孢子蟲卵囊(~1 x 105)。采用小隱孢子蟲特異性引物對糞便進行定量聚合酶鏈反應(yīng)(qPCR)檢測。三種強效化合物(BRD7929, BRD3316, BRD3444, C.parvum EC50 <73 nM)及陰性和陽性對照以每24小時50 mg/kg(體重)口服給藥，共4天。三種雙環(huán)氮雜環(huán)類化合物治療后卵囊脫落率均較低(BRD7929的P < 0.05)。特別是，BRD7929顯示每毫克糞便的卵囊減少了近3-log。然后，使用相同的免疫缺陷小鼠模型對BRD7929進行了劑量范圍研究，給藥方案為每24小時給藥5, 20, 40 mg/kg，連續(xù)4天，檢測卵囊脫落率；每24小時給藥10mg/kg，連續(xù)7天，觀察小鼠14天是否感染復(fù)發(fā)。BRD7929的劑量為每24小時10mg/kg，連續(xù)7天，14天后無復(fù)發(fā)。除了BRD8494外，雙環(huán)氮雜類藥物耐受性良好。在體內(nèi)測試的八種其他雙環(huán)丙嗪類藥物的體重減輕<5%，并且沒有觀察到小鼠行為學上的不良影響。

    接下來，研究人員檢測了這些雙環(huán)氮雜環(huán)類化合物在體內(nèi)最佳PK/PD關(guān)系。隱孢子蟲感染的原發(fā)部位是腸上皮，這與瘧疾不同，瘧原蟲在肝細胞和紅細胞中發(fā)育。雖然良好的腔內(nèi)暴露對體內(nèi)療效很重要，但對于治療隱孢子蟲病所需的最佳生物利用度，目前尚無整體共識。減少全身性暴露可提高隱孢子蟲病藥物的安全性，然而，有一種擔憂是，僅在胃腸道暴露可能導(dǎo)致與疾病相關(guān)的水樣腹瀉的藥物沖刷，并且可能不是治療膽道上皮感染的最佳方法。于是，研究人員確定了8種化合物(包括BRD7929、BRD3316和BRD3444)的生物利用度為從1到86%，具有較高生物利用度的類似物(BRD7929、BRD8494和BRD6630)每毫克糞便中卵囊減少量最大。

    研究人員基于隱孢子蟲的生命周期，使用一系列表型分析進一步在體外研究了BRD7929的抗隱孢子蟲作用機制。EdU熒光顯微鏡檢測發(fā)現(xiàn)，BRD7929對寄生蟲侵襲宿主細胞的過程沒有影響，但強烈抑制細胞內(nèi)寄生蟲的發(fā)育。通過監(jiān)測BRD7929在培養(yǎng)的前48小時對無性繁殖的影響，以及性發(fā)育生物標志物減數(shù)分裂重組蛋白DNA減數(shù)分裂重組酶1 (DMC1)的表達情況，比較了BRD7929對小孢子蟲性發(fā)育的抑制作用和對無性繁殖的抑制作用，48到72小時的培養(yǎng)時間與其他隱孢子蟲aaRS抑制劑觀察到的一樣，BRD7929在兩種檢測中幾乎是等效的，即生長和發(fā)育階段有相同的抑制效果。要想成功治療艾滋病患者、移植受者和營養(yǎng)不良兒童等免疫缺陷患者，可能需要藥物能在缺乏免疫系統(tǒng)大量幫助的情況下迅速消滅寄生蟲。感染了C. parvum的NSG小鼠在使用慢效抗隱孢子蟲的盤龍霉素和氯法齊明治療后迅速復(fù)發(fā)或沒有任何改善，但這兩種化合物對免疫缺陷較輕的小鼠都有效。與在NSG小鼠模型中觀察到的效果一致的是，BRD7929能快速從體外培養(yǎng)中去除C. parvum，在濃度為3×EC90時首次達到最大清除率。在體外，BRD7929對寄生蟲的消除呈指數(shù)增長，消除99.9%的寄生蟲的半數(shù)時間為~9.5和~95小時。

    此前對惡性瘧原蟲進行的體外抗性選擇實驗和全基因組測序發(fā)現(xiàn)了PheRS中的點突變，這些突變賦予了對雙環(huán)氮雜環(huán)化合物BRD1095的抗性，尤其是評估小隱孢子蟲中內(nèi)源的482位亮氨酸突變?yōu)槔i氨酸，是否會獲得對BRD7929的抗性。研究人員用這種混合的轉(zhuǎn)基因寄生蟲(L482 + V482)或?qū)φ?WT L482)，用BRD7929 (10 mg/kg)處理5天(感染后第4至8天)。通過測量糞便中的發(fā)光來跟蹤寄生蟲的脫落情況，發(fā)現(xiàn)在藥物處理3天后(感染第7天)，兩株菌株的熒光素酶活性均有所下降，但混合種群的寄生蟲明顯反彈。在治療后的第8天和第11天通過PCR擴增pheRS基因，每天測序8個獨立克隆。與輸入群體相比，恢復(fù)的序列均在核苷酸1444位發(fā)生突變，丟失了野生型等位基因，說明該482位突變在BRD7929處理下具有選擇優(yōu)勢。

    為了進一步確定CpPheRS作為本系列的分子靶標，研究人員純化了重組ChPheRS蛋白，并測定了其在雙環(huán)氮雜環(huán)化合物作用下的氨基酰化酶的活性。在氨基?；磻?yīng)的第一步，PheRS使用ATP和L-苯丙氨酸形成氨基?；佘账釓?fù)合物，釋放焦磷酸(PPi)。在第二步，氨基?；D(zhuǎn)移到同源tRNA釋放AMP。在這里，我們用孔雀石綠吸光度法測定了PPi轉(zhuǎn)化為無機磷酸鹽(Pi)后的產(chǎn)量。BRD7929對重組ChPheRS的抑制作用呈濃度依賴性(IC50 = 60 nM)。在此生化試驗中觀察到的效力與人隱孢子蟲試驗中觀察到的效力相似BRD7929 ChPheRS(1%胎牛血清)EC50 = 10nM，提示抑制ChPheRS完全解釋了觀察到的細胞效能。ChPheRS對BRD7929的生化效力也與之前報道的PfcPheRS相似(IC50 = 23 nM)，進一步表明了一種保守的作用機制。

本文的研究人員使用老藥新用的化合物重定位的方法，節(jié)省了新藥開發(fā)的經(jīng)濟成本，縮短了開發(fā)時間，并且結(jié)合表型篩選和結(jié)構(gòu)篩選的優(yōu)點，為被忽視疾病的藥物開發(fā)提供了良好的新思路。

參考文獻：

[1] Vinayak S, Jumani R S, Miller P, et al. Bicyclicazetidines kill the diarrheal pathogen Cryptosporidium in mice by inhibitingparasite phenylalanyl-tRNA synthetase[J]. Science Translational Medicine, 2020,12(563).