北京大學(xué)生物醫(yī)學(xué)前沿創(chuàng)新中心（BIOPIC）、生命科學(xué)學(xué)院研究員

名校學(xué)子， 回報(bào)母校

據(jù)了解，白凡早前畢業(yè)于北京大學(xué)物理系，在遠(yuǎn)赴英國(guó)牛津大學(xué)攻讀并取得博士學(xué)位后，他曾先后在牛津大學(xué)和大阪大學(xué)（日本）進(jìn)行過(guò)博士后研究。2011年，滿(mǎn)載著國(guó)外留學(xué)和科研工作中積累的豐富學(xué)識(shí)和經(jīng)驗(yàn)，白凡選擇回到母校任職，并先后承擔(dān)多項(xiàng)自然科學(xué)基金委、科技部和北京市科委的科研項(xiàng)目。在北大工作期間，白凡研究員和團(tuán)隊(duì)一直致力于通過(guò)對(duì)癌癥病人外周血循環(huán)腫瘤細(xì)胞（circulating tumor cell, CTC）進(jìn)行單細(xì)胞分析，深入探索癌癥轉(zhuǎn)移的分子生物學(xué)機(jī)制以及實(shí)現(xiàn)無(wú)創(chuàng)癌癥診斷、預(yù)后判斷、療效評(píng)價(jià)的臨床方法。

近年來(lái)，他們已經(jīng)利用單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)在CTC、腫瘤異質(zhì)性及克隆起源等課題上取得了重大突破和進(jìn)展。他們?cè)谑澜绶秶鷥?nèi)第一個(gè)報(bào)道了單個(gè)CTC的全基因組測(cè)序結(jié)果并獲得廣泛關(guān)注 （PNAS，2013）；他們通過(guò)單細(xì)胞基因測(cè)序分析了結(jié)直腸癌、乳腺癌、胃癌、前列腺癌以及肝癌等不同癌種中CTCs的特征與差異，進(jìn)一步揭示了腫瘤轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制和克隆起源等問(wèn)題，具有重要的科學(xué)意義和臨床價(jià)值（Genome Research，2017）。近期，白凡研究團(tuán)隊(duì)又把研究重點(diǎn)轉(zhuǎn)到了小細(xì)胞肺癌上，通過(guò)CTCs實(shí)現(xiàn)對(duì)小細(xì)胞肺癌腫瘤突變特征的無(wú)創(chuàng)探測(cè)和病人化療敏感性的預(yù)測(cè)（Clinical Cancer Research, 2019）。

循環(huán)腫瘤細(xì)胞在癌癥轉(zhuǎn)移中的中介作用 

如今，CTCs的定義已經(jīng)比較明確——它們是以不同形態(tài)存在于外周血中的各類(lèi)腫瘤細(xì)胞的統(tǒng)稱(chēng)，既有游離的單個(gè)CTC，也有聚集成團(tuán)的細(xì)胞團(tuán)（CTM，Circulating Tumor Microemboli）。它們?cè)从谧园l(fā)或臨床診療操作中從實(shí)體腫瘤病灶（腫瘤原發(fā)灶或轉(zhuǎn)移灶）的脫落，能夠越過(guò)組織間基底膜并入侵組織基質(zhì)，從而進(jìn)入血液循環(huán)系統(tǒng)。

“現(xiàn)在，我們對(duì)癌癥轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵步驟已經(jīng)有了比較清晰的認(rèn)識(shí)，而CTC在癌癥轉(zhuǎn)移中起了關(guān)鍵的中介作用，”白凡研究員介紹道，“當(dāng)這些CTCs進(jìn)入到血液循環(huán)系統(tǒng)后，它們就會(huì)沿著血液快速地?cái)U(kuò)張到其他身體部位。雖然這一過(guò)程中大部分CTCs會(huì)發(fā)生凋亡或被吞噬，但少數(shù)能夠逃逸并存活。一旦這些逃逸的CTCs在一些其他組織的毛細(xì)血管里停留下來(lái)，就會(huì)啟動(dòng)另一過(guò)程離開(kāi)毛細(xì)血管去重新建立和發(fā)展成為新的轉(zhuǎn)移灶。這大大增加了惡性腫瘤患者的死亡風(fēng)險(xiǎn)。” 

事實(shí)上，早在一個(gè)多世紀(jì)前（1869年），澳大利亞籍醫(yī)生Thomas Ashworth 就在癌癥病人中首次觀(guān)測(cè)到了CTC。他發(fā)現(xiàn)病人外周血中一些異常形態(tài)的細(xì)胞與癌細(xì)胞非常相似，于是提出了這樣的猜測(cè)：那些異常形態(tài)的細(xì)胞是否與癌癥的廣泛多器官轉(zhuǎn)移有著直接的關(guān)系呢？遺憾的是，當(dāng)時(shí)Thomas Ashworth無(wú)法提取CTCs來(lái)繼續(xù)追蹤它們的“來(lái)龍去脈”。

研究者多年來(lái)都希望能夠從病人外周血中捕獲CTCs來(lái)進(jìn)行更有效的研究，但這一細(xì)胞群體的數(shù)量十分稀少，而且混雜在大量的血細(xì)胞之中。條件和技術(shù)的限制使得CTCs的研究一直受阻。白凡研究員解釋說(shuō)：“正常人1m?l血液里大概有1億血紅細(xì)胞，100萬(wàn)左右白細(xì)胞。然而在一毫升癌癥病人血液里，往往只能分離到幾個(gè)到幾十個(gè)CTC?s。因此，捕獲和分離CTCs去進(jìn)一步研究是一個(gè)十分有挑戰(zhàn)的難題。”一些研究也表明：1 g腫瘤組織，大約有100萬(wàn)個(gè)腫瘤細(xì)胞，可每日播散腫瘤細(xì)胞進(jìn)入血液。然而CTCs的數(shù)量在循環(huán)血液中常呈現(xiàn)出動(dòng)態(tài)遞減的特點(diǎn)，到達(dá)外周血時(shí)已十分稀少。

單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)鑒定和表征循環(huán)腫瘤細(xì)胞

直到近些年，對(duì)細(xì)胞富集、分離和鑒定分析等新技術(shù)的快速發(fā)展以及測(cè)序技術(shù)的飛躍重新點(diǎn)燃了CTCs這一領(lǐng)域的研究，讓CTCs作為一種臨床中切實(shí)可行的腫瘤評(píng)估方法逐漸變成可能。白凡研究團(tuán)隊(duì)最早關(guān)于CTCs的研究是從分析肺癌病人CTCs的基因組拷貝數(shù)變化 （copy number variation-CNV）模式和點(diǎn)突變開(kāi)始的?，F(xiàn)在已經(jīng)有很多的不同的方法來(lái)分離CTCs，他們主要通過(guò)目前唯一經(jīng)美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局(Food and Drug Administration，F(xiàn)DA)批準(zhǔn)用于檢測(cè)CTCs的Cell search平臺(tái)來(lái)獲取和分離單個(gè)CTC，并對(duì)其遺傳物質(zhì)進(jìn)行擴(kuò)增和全基因組測(cè)序。這一突破性結(jié)果發(fā)表在2013年《PNAS》上，并在同年《Nature Methods》特別報(bào)道中（singled out for sequencing ）得到重點(diǎn)引用。

在分析了CTC單細(xì)胞全基因組的CNV模式并將該數(shù)據(jù)與相關(guān)實(shí)體腫瘤平行數(shù)據(jù)進(jìn)行比較后，白凡研究團(tuán)隊(duì)發(fā)現(xiàn)CTCs與原發(fā)位和轉(zhuǎn)移位腫瘤中存在明確的基因共同區(qū)域的缺失與擴(kuò)增，而且來(lái)自同一病人CTCs 的CNV 模式具有一致性。同時(shí)，同一亞型的肺癌患者中，CNV模式在肺癌發(fā)生發(fā)展的重要區(qū)域存在明顯的相似性（如：第8號(hào)染色體的后半段有明顯擴(kuò)增）；而在不同亞型的肺癌患者中 （如肺腺癌和小細(xì)胞肺癌），CNV呈現(xiàn)出了不同的模式。白凡研究員總結(jié)道：“這提示可以對(duì)外周血CTCs進(jìn)行全基因組CNV檢測(cè)，根據(jù)CNV推測(cè)肺癌的不同亞型。”

2013 《Nature Methods》上 singled out for sequencing 特別報(bào)道

不僅如此，白凡研究團(tuán)隊(duì)還通過(guò)CTCs基因測(cè)序在肺腺癌向小細(xì)胞肺癌轉(zhuǎn)化的患者中發(fā)現(xiàn)，癌癥治療中產(chǎn)生的耐藥性與特定抑癌基因的點(diǎn)突變具有明確相關(guān)性。結(jié)合病理判斷，他們進(jìn)一步驗(yàn)證了在產(chǎn)生耐藥性后癌癥能夠以CTCs為途徑從肺部原發(fā)灶向肝部形成新的轉(zhuǎn)移灶。“這些結(jié)果說(shuō)明，對(duì)CTCs的分析可以幫助獲取病人的靶向用藥、耐藥、表型轉(zhuǎn)換等臨床非常關(guān)聯(lián)的重要信息。”白凡研究員這樣評(píng)價(jià)。另外，他們還通過(guò)外周血CTCs基因測(cè)序觀(guān)測(cè)了癌癥治療中不同時(shí)間點(diǎn) （如化療前、一線(xiàn)化療和二線(xiàn)化療）所發(fā)生的點(diǎn)突變，來(lái)探知腫瘤克隆的演化過(guò)程。

在已有的肺癌研究基礎(chǔ)上，白凡研究團(tuán)隊(duì)又將分析經(jīng)驗(yàn)應(yīng)用到其它中國(guó)人高發(fā)的癌癥中，如：對(duì)胃癌和乳腺癌進(jìn)行分型、預(yù)測(cè)前列腺癌激素治療效果，鑒定結(jié)直腸癌轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵標(biāo)志物等。他們將多個(gè)癌種的研究結(jié)果匯總，進(jìn)行了跨癌種綜合分析，特別關(guān)注了與癌癥轉(zhuǎn)移驅(qū)動(dòng)時(shí)間相關(guān)的CNV變化，相關(guān)結(jié)果在2017年發(fā)表在《Genome Research》 上。

從單細(xì)胞層面理解腫瘤細(xì)胞異質(zhì)性和克隆起源

伴隨生命科學(xué)認(rèn)識(shí)的深入，研究者們?cè)絹?lái)越多地發(fā)現(xiàn)同一組織的細(xì)胞之間或同一類(lèi)型的細(xì)胞之間事實(shí)上存在著不同程度的差異，這些差異被稱(chēng)為細(xì)胞間的“異質(zhì)性”。在許多生命活動(dòng)的關(guān)鍵問(wèn)題上，單個(gè)細(xì)胞所發(fā)揮的作用其實(shí)是非常重要的，如在胚胎發(fā)育，腫瘤，不可培養(yǎng)微生物等的研究上。

腫瘤中的單個(gè)細(xì)胞間可以存在很大程度的差異，高度異質(zhì)性的細(xì)胞對(duì)癌組織的表型有高度的塑造作用。白凡研究員認(rèn)為，腫瘤的異質(zhì)性是腫瘤在發(fā)生發(fā)展的長(zhǎng)期演化過(guò)程中，不同的腫瘤克隆之間存在相互競(jìng)爭(zhēng)的情況下產(chǎn)生的。這種細(xì)胞間的異質(zhì)性對(duì)現(xiàn)在的腫瘤治療帶來(lái)了很大的挑戰(zhàn)。

傳統(tǒng)研究依賴(lài)于群體細(xì)胞測(cè)量，通常把同一組織或同一類(lèi)型的大量細(xì)胞作為研究對(duì)象，會(huì)掩蓋單個(gè)細(xì)胞之間的差異，因此具有局限性。白凡研究員表示，現(xiàn)在有了單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)，就可以以單個(gè)細(xì)胞的精度去研究。如果再結(jié)合生物信息學(xué)的方法，就能夠準(zhǔn)確地把整個(gè)腫瘤的異質(zhì)性和它的演化歷史以最高的精度去重現(xiàn)。白凡研究團(tuán)隊(duì)利用單細(xì)胞基因測(cè)序的結(jié)果構(gòu)建了進(jìn)化樹(shù)，并分析了肝癌不同亞型以及混合型肝癌的異質(zhì)性。此外，他們還發(fā)現(xiàn)了混合型肝癌中不同克隆間獨(dú)立和共同起源并存的情況并推測(cè)了其可能的轉(zhuǎn)移路徑。相關(guān)結(jié)果于2019年發(fā)表在《Cancer Cell》上。

世界肝癌分布（A）、肝癌發(fā)病位置(B)和肝癌異質(zhì)性(C) （Xue et al., 2017）

近期有一些研究表明，癌癥耐藥性與不同藥物作用下細(xì)胞的異質(zhì)性反應(yīng)有關(guān)。對(duì)此，白凡研究員也給出了自己的看法：“癌癥的耐藥性確實(shí)是一個(gè)非常復(fù)雜的問(wèn)題。除了研究腫瘤細(xì)胞本身，對(duì)于免疫細(xì)胞和其它對(duì)腫瘤的發(fā)生發(fā)展有很大促進(jìn)作用的因素也要深入研究和理解。因此，可從兩個(gè)方面去考慮：第一個(gè)是遺傳層面。也就是說(shuō)腫瘤細(xì)胞發(fā)生了基因型的變化，產(chǎn)生新的基因型來(lái)適應(yīng)藥物的處理以存活下去；另一方面就是非遺傳層面，像是復(fù)雜的腫瘤微環(huán)境所帶來(lái)的影響會(huì)增強(qiáng)腫瘤的耐藥性，又或者是腫瘤的表型上的一些改變，比如有些腫瘤細(xì)胞能夠?qū)⒁恍┗熕幬镉行У嘏懦鰜?lái)，可以稱(chēng)之為‘外排泵 ’作用，不讓它對(duì)腫瘤細(xì)胞進(jìn)行殺傷。這同樣會(huì)增強(qiáng)它的耐藥性。”

對(duì)未來(lái)癌癥治療藥物的研發(fā)，白凡研究員也談?wù)摿艘恍┱雇?。具體來(lái)說(shuō)，傳統(tǒng)的大量樣本研究只針對(duì)一些重要的基因突變，伴隨著技術(shù)的進(jìn)步，未來(lái)的癌癥治療還是有很多的潛力?，F(xiàn)在有了單細(xì)胞精度的癌癥研究，研究人員就可以對(duì)腫瘤細(xì)胞里面一些特殊的群體，比如像腫瘤干細(xì)胞或是同時(shí)具有多種表型的腫瘤細(xì)胞，又或是對(duì)腫瘤微環(huán)境中幫助腫瘤生長(zhǎng)的細(xì)胞類(lèi)群及其它因素，進(jìn)行更深入的研究和理解。這些新知識(shí)的獲取會(huì)帶來(lái)一些新的藥物設(shè)計(jì)的思路，展開(kāi)一些新的癌癥研究領(lǐng)域。